TGF-β1调控CTGF促心房结构重构的分子机制和干预研究

【摘要】研究背景及目的：心房颤动(AtrialFibrillation)是心血管内外科的常见病、多发病，随着年龄的增长，其发病率逐渐增加。随着世界人口老龄化趋势的加速，房颤已成为影响公众健康的重要医疗问题。因其病因及发病机制仍未完全明确，导致临床上对于房颤的治疗缺乏安全有效的方法，大多仍局限于症状治疗及其并发症的预防。新近研究表明，以心房纤维化为主要表现的心房结构重构是心房颤动发生、持续以及转复后再次复发的重要因素，转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)是重要的促纤维化因子，在房颤心房纤维化过程中可能是通过TGF-β1/Smad信号通路调控其下游基因结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)，参与心房纤维化及心房结构重构进程。血管紧张素II(AngiotensinII，AngII)可以通过血管紧张素II1型受体(AngiotensinIIType1Receptor，AT1receptor)途径上调TGF-β1的表达，发挥重要的促纤维化作用。AngII也可以上调CTGF的表达，导致心室间质纤维化，引起心室重构。但房颤时AngII是否也通过上调CTGF导致心房纤维化及心房结构重构，AngII对CTGF的调控是否通过TGF-β1信号通路得以实现，仍需深入研究。本课题以临床房颤患者手术标本、心房纤维化动物模型及心房成纤维细胞为研究对象，采用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹(WesternBlot，WB)、免疫荧光、RNA干扰等技术，从临床、在体模型及细胞水平三个层面系统阐述AngII诱导的TGF-β1/Smad/CTGF信号通路在房颤心房纤维化及心房结构重构中的作用及具体分子机制，为临床上房颤的治疗提供理论支持和实验依据。研究方法：本研究分为三部分：第一部分：对临床慢性房颤患者及窦性心律患者右心房组织纤维化程度进行对比，胶原纤维染色检测胶原分布情况，荧光定量PCR、蛋白免疫印迹及组织免疫荧光等方法检测右心房组织中TGF-β1、Smad3以及CTGF在基因及蛋白水平的表达变化。第二部分：通过建立AngII刺激致小鼠心房纤维化动物模型，观察模型小鼠心律变化，采用Masson及天狼猩红苦味酸染色法观察心房组织纤维化情况，采用实时荧光定量PCR技术测定两组小鼠心房组织中I型胶原、TGF-β1以及CTGFmRNA的表达，进一步分离培养来自模型动物左心房的原代成纤维细胞，采用实时荧光定量PCR检测TGF-β1相关信号通路基因在成纤维细胞内的表达情况。第三部分：选用体外培养的乳大鼠原代心房成纤维细胞为研究对象，通过AngII刺激、AT1受体阻断、小干扰RNA干扰TGF-β1及CTGF等方法，观察干预因素对细胞形态学的影响，实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测AngII/AT1-R/TGF-β1/Smad/CTGF信号通路相关基因和下游纤维化指标I型胶原以及纤维连接蛋白的mRNA及蛋白表达变化。研究结果：主要研究结果如下：1.慢性房颤组患者右心房胶原含量较窦性心律组明显增加，胶原容积分数也明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；2.慢性房颤组患者右心房组织中TGF-β1及Smad3mRNA及蛋白水平较窦性心率组均增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；3.慢性房颤组患者右心房组织中CTGFmRNA及蛋白水平较窦性心率组均增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且慢性房颤组CTGF在蛋白水平上与TGF-β1蛋白成正相关(直线相关系数r=0.528,p<0.05)，Smad3蛋白表达与TGF-β1蛋白表达也具有相关性(直线相关系数r=0.757,p<0.05)；4.慢性房颤组患者TGF-β1及CTGF蛋白均与胶原容积分数(CVF)成正相关(TGF-β1蛋白直线相关系数r=0.580,p<0.01;CTGF蛋白直线相关系数r=0.626,p<0.05)；5.AngII致小鼠心房纤维化实验组心电图呈持续性房颤或阵发性房颤改变；6.病理染色结果表明，与对照组比较，实验组小鼠左心房组织胶原增多，心房发生显著纤维化，且左心房纤维化程度重于右心房；7.实验组小鼠左心房组织中TGF-β1、CTGF及CollagenImRNA表达较对照组显著增高(P<0.01)；8.实验组小鼠左心房分离得到的原代心房成纤维细胞中TGF-β1、Smad3及CTGF9.AngII可以诱导乳大鼠原代成纤维细胞增殖，选择性AT1受体拮抗剂氯沙坦预处理、TGF-β1siRNA或CTGFsiRNA干扰均能抑制由AngII诱导的成纤维细胞增殖；10.AngII可诱导乳大鼠原代心房成纤维细胞中的TGF-β1、p-Smad3、CTGF、纤维连接蛋白及I型胶原表达上调，并且TGF-β1siRNA干扰能下调AngII诱导的p-Smad3、CTGF、纤维连接蛋白及I型胶原表达，而针对CTGF基因的siRNA干扰能下调AngII诱导的纤维连接蛋白及I型胶原表达；11.氯沙坦预处理可以下调AngII诱导的TGF-β1、p-Smad3、CTGF、纤维连接蛋白及I型胶原表达。结论：1、临床房颤患者存在以心房纤维化改变为主要特征的心房结构重构。TGF-β1、Smad3和CTGFmRNA及蛋白表达在慢性房颤患者右心房组织中明显增加，提示在房颤患者心房结构重构进程中，CTGF可能作为TGF-β1/Smad信号通路的下游介质，在房颤的发生及维持过程中发挥生物学效应。2、通过对AngII致心房纤维化动物模型的研究，初步证实AngII可诱导心房成纤维细胞中的TGF-β1/Smad信号通路及CTGF的表达上调，并在心房组织纤维化及心房颤动的发生和维持过程中起重要作用。3、通过对乳大鼠心房成纤维细胞的AngII诱导及干预研究，进一步证实AngII/AT1-R/TGF-β1/Smad/CTGF途径可能是心房纤维化进程中的重要信号通路，CTGF可以作为TGF-β1的下游促纤维化因子，参与房颤心房纤维化及心房结构重构进程。
【作者】李勇；
【导师】肖颖彬；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】心房颤动；心房纤维化；心房结构重构；转化生长因子β1(TGF-β1)；结缔组织生长因子(CTGF)；血管紧张素II；血管紧张素II1型受体(AT1-R)；

【参考文献】
[1]肖迪.基于虚拟现实技术的电能计量实训仿真研究[D].华中科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[2]何辉.突出以人为本坚持五个强化不断推进企业安全文化建设[J].现代职业安全.2002(07)
[3]赵耿龙.基于行为金融理论的股价波动典型现象研究[D].南京大学,金融学,2013,硕士.
[4]张楠.基于费氏三维模型的批评性话语分析[D].首都师范大学,德语语言文学,2014,硕士.
[5]冯雪.VEGF基因的RNA干扰及其在肝癌MHCC97L细胞表达的实验研究[D].北京中医药大学,中西医结合临床,2014,硕士.
[6]缪志高.半监督排序学习算法研究[D].中国科学技术大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[7]王晓琳.董事会特征对XBRL标准会计信息质量影响的实证研究[D].西北大学,会计学,2013,硕士.
[8]赵海洋.XX航运公司薪酬体系优化设计研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[9]赵辉.基于Q学习算法的机械臂轨迹规划研究[D].东北石油大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[10]曾海彬.烟草体内维生素B_6代谢的研究[D].安徽农业大学,食品科学,2011,硕士.
[11]田丁丁.石墨烯技术国际发展趋势分析[N].中国知识产权报,2013-10-30007.
[12]穆兴中.基于GPRS的视频采集系统[D].宁波大学,电路与系统,2013,硕士.
[13]王苹.基于实物期权模型对采矿权评估的案例研究[D].成都理工大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[14]王瑞.家长式领导对员工关系行为的影响[D].华中师范大学,应用心理,2014,硕士.
[15]王亚琼.政治文明视野下我国大学生志愿精神的培育[D].武汉纺织大学,思想政治教育,2014,硕士.
[16]王相蓉.社交自我效能感：跨文化的修订与应用[D].华东师范大学,应用心理学,2013,硕士.
[17]涂军明.长江流域早稻稻瘟病抗性分子改良育种[D].中国农业科学院,作物（专业学位）,2012,硕士.
[18]时美楠.南海海槽增生楔沉积物环境磁学研究[D].中国地质大学（北京）,海洋地质,2014,硕士.
[19]马梓山.刑事责任基本问题论[D].苏州大学,法律,2003,硕士.
[20]甄子洋,王志胜,王道波.基于信息融合最优估计的非线性离散系统预测控制[J].自动化学报,2008,03:331-336.
[21]刘治凡,陈振声,宋锡熊.高分辨率地震勘探在北三台地区的应用效果[J].石油地球物理勘探,1990,05:624-638+646.
[22]陶岳.关系数据库上基于组的关键字查询研究[D].复旦大学,计算机软件与理论,2012,硕士.
[23]许力慧.现代科学教育发展背景下的科学课程改革与实践[D].上海师范大学,2004.
[24]许凌燕.宁波银行小企业融资业务营销策略研究[D].宁波大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[25]孟志青.一类相邻时态关联规则的知识发现问题[J].模式识别与人工智能,2001,04:458-462.
[26]林芳华.我国风险投资减持模式与内幕交易行为的实证研究[D].厦门大学,财务学,2014,硕士.
[27]刘晓辉.内蒙古东部地区电力市场营销模式及管理研究[D].大连理工大学,2003.
[28]孙永军.基于多智能体的多元技术创新扩散仿真研究[D].杭州电子科技大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[29]张文德.论图书馆整合[J].中国图书馆学报,2005,03:37-41.
[30]曹亚廷.信用衍生品发展与银行业稳定：理论与实证[D].复旦大学,金融学,2013,博士.
[31]严矿林,肖小华,李攻科.表面增强拉曼光谱在食品安全分析中的应用[J].化学通报,2014,05:388-395.
[32]李崇坚.交交变频正弦波型自控同步电机传动系统的分析[J].冶金自动化,1984,01:11-17.
[33]范立衡.基于键值存储引擎的元数据管理集群副本一致性的研究[D].杭州电子科技大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[34]郑思华.数据挖掘在移动大客户流失预测中的应用[D].南京理工大学,2004.
[35]王靖雄.基于DM8148处理器的视频处理系统软件研发[D].浙江大学,电子信息技术及仪器,2013,硕士.
[36]蔡达莉.我国传统工艺的知识产权保护[D].华侨大学,法律,2013,硕士.
[37]胡沛.麻黄梁煤矿综放面矿压规律及支架工作阻力研究[D].西安科技大学,采矿工程,2013,硕士.
[38]BishwoPrachandaSedhain（韩音）.Use of Reabsorbable Screw and Plate in Mandibular Fracture[D].华中科技大学,OralandMaxillofacialSurgery,2013,硕士.
[39]祁育.基于OSGi的培训平台设计与实现[D].华中科技大学,软件工程,2013,硕士.
[40]周炳卿.家蚕Foxo基因的克隆及其在丝腺程序性细胞死亡中的功能研究[D].苏州大学,发育生物学,2012,硕士.
[41]杨明洁.有限责任合伙法律问题研究[D].华中师范大学,民商法学,2014,硕士.
[42]许金德.朱熹思想与中医养生文化研究[D].福建中医药大学,中医医史文献,2012,硕士.
[43]柳志鹏.中共执政合法性基础面临的挑战分析及对策研究[D].湖北工业大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[44]綦振法,徐福缘.MIS的发展与企业组织创新[J].华东经济管理,2001,01:29-31.
[45]沈备军.企业网络计算的参考框架与关键技术及其支持环境的研究[D].中国科学院研究生院（软件研究所）,2001.
[46]黄彩霞.明清徽商与江南粮食市场[D].安徽师范大学,中国古代史,2004,硕士.
[47]孙佳佳.调车安全监控系统站场分机软件设计[D].西南交通大学,交通运输工程,2014,硕士.
[48]史志勇.利用影响力受贿罪若干问题研究[D].吉林大学,法律,2012,硕士.
[49]胡云佳,董占奎,宋向荣,刘朝锋.首钢京唐1580mm热连轧机精轧过程控制模型及应用[J].冶金自动化,2012,02:26-29.
[50]张皓钧.SCARA机器人运动学参数与视觉标定研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2013,硕士.